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PNPLA3、Sort1基因多態性與酒精性肝病易感性的關系

發布時間:2019-10-12 15:06:17 作者:孤陋寡聞 審核編輯:本站小編 點擊:下載該Word文檔收藏本文

摘要目的 探討PNPLA3、Sort1基因多態性與酒精性肝病易感性的關系。方法 選取20171月至20183月在我院治療的酒精性肝病患者110例(病例組),同時選取長期大量飲酒但未被診斷酒精性肝病患者100(無肝病嗜酒組)、健康自愿者200例(對照組),檢測各組PNPLA3、Sort1基因多態性。結果 PNPLA3基因rs738409位點檢測出CC、CG、GG三種基因型,Sort1基因rs646776位點檢測出CC、TC、TT三種基因型;病例組PNPLA3基因GG型和等位基因G的比例分布為23.64%45.45%,明顯高于無肝病嗜酒組和對照組(p0.05);各組Sort1基因多態性分布差異比較無統計學意義(p0.05);病例組不同PNPLA3基因型患者TG、TC、HDL-CLDL-C比較差異無統計學意義(p0.05);病例組Sort1基因TT型患者TG為(1.61±0.30mmol/L,高于CC+CT型患者,而HDL-C為(1.80±0.65mmol/L,低于CC+CT型患者(p0.05)。結論 PNPLA3基因多態性與酒精性肝病易感性有一定關系,Sort1基因多態性與酒精性肝病易感性無明顯關系,但與患者的血脂水平具有一定的相關性。

【關鍵詞】 PNPLA3基因;Sort1基因;基因多態性;酒精性肝;遺傳易感性

Association of PNPLA3 and Sort1 gene polymorphisms with susceptibility to alcoholic liver disease

Lixiaofei,zhangliping,guoyongsheng

1. Department of Infectious,Jiaozuo Third People's Hospital, Jiaozuo, Henan 454000;

2.Operation room, Jiaozuo People's Hospital, Jiaozuo, Henan, 454000

3.Jiaozuo Shanyang District CDC, Henan Jiaozuo, 454000

[Abstract]Objective: To investigate the association between PNPLA3 and Sort1 gene polymorphisms and susceptibility to alcoholic liver disease.Methods: 110 cases of alcoholic liver disease (case group) were selected from January 2017 to March 2018 in our hospital, 100 cases without alcoholic liver disease who had been drinking heavily for a long time (without liver disease alcoholism group) and 200 healthy volunteers (control group) were selected, PNPLA3 and Sort1 gene polymorphisms were detected in each group.Results:PNPLA3 gene rs738409 loci detected three genotypes of CC, CG and GG. Sort1 gene rs646776 loci detected three genotypes of CC, TC and TT; The proportions of PNPLA3 genotype GG and allele G in case group were 23.64% and 45.45%, which were significantly higher than those without liver disease alcoholism group and control group (P < 0.05); There was no significant difference in the distribution of Sort1 gene polymorphisms among each groups (P > 0.05); There were no significant difference in TG, TC, HDL-C and LDL-C in patients with different PNPLA3 genotypes (P > 0.05); The TG of Sort1 gene TT in case group was (1.61±0.30) mmol/L, higher than that of type CC+CT, and HDL-C was (1.80±0.65) mmol/L, lower than that of CC+CT type (P < 0.05).Conclusion:The polymorphism of PNPLA3 gene is related to the susceptibility of alcoholic liver disease, the polymorphism of Sort1 gene is not related to the susceptibility of alcoholic liver disease, but it may be related to the level of blood lipid in patients.

[Keywords] PNPLA3 gene; Sort1 gene; gene polymorphism; alcoholic liver disease; genetic susceptibility

 

酒精性肝病屬于臨床常見的肝臟疾病,主要是長期大量飲酒引發,近年來酒精性肝病的發病率呈現升高的趨勢,對患者的生理和心理產生嚴重的影響,目前臨床按照患者病情與病程將酒精性肝病分為酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化與酒精性肝硬化,有學者認為本病的發生同肝臟脂肪代謝存在關系,目前對疾病發生機制方面研究較多[1]。有學者報道乙醇在攝入人體內90%以上通過肝臟進行代謝,而酒精代謝過程在不同人群中會表現出個體化的差異性,基因多態性的研究在臨床越來越廣泛,有研究發現patatin樣磷脂酶3(patatin likephospholipase domain containing 3,PNPLA3)基因的非同義序列變異在人體肝臟脂肪變性中發揮了重要作用,該基因編碼的一種跨膜蛋白被證明在肝細胞膜中顯著表達;Sort1則是脂質代謝調節基因,由Sort1編碼分揀蛋白是載脂蛋白B100的受體,主要定位在高爾基體的細胞內蛋白,同人體的脂質代謝調節關系密切[2]。本研究通過觀察PNPLA3、Sort1基因多態性同酒精性肝病易感性之間的關系,為臨床尋找酒精性肝病發生的風險因素,以期為臨床提供指導和依據,現匯報如下。

 

1資料與方法

1.1一般資料 

選取20171月至20183月在我院治療的酒精性肝病患者110例(病例組),同時選取長期大量飲酒但未被診斷酒精性肝病患者100(無肝病嗜酒組)、健康自愿者200例(對照組),納入標準:(1)診斷符合《酒精性肝病診療指南》中的標準;(2)病例組和無肝病嗜酒組飲酒嗜酒5年,乙醇量:男性40g/d,女性20g/d;(3)對照組受試者不飲酒;(4)所有受試者知情同意。排除標準:(1)合并有HAV、HBV等肝炎病毒感染、藥物性肝病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病等;(2)已行肝移植手術者。各組受試者一般資料比較差異無統計學意義(p0.05),見表1。

1 各組一般資料比較

組別

例數

/

年齡(歲)

乙醇量(g/d

飲酒時間(年)

對照組

200

190/10

50.41±6.46

-

- 

無肝病嗜酒組

100

95/5

49.25±7.15

64.42±12.24

14.25±2.24

病例組

110

107/3

51.03±8.22

65.58±13.30

14.65±2.30

F/c2


0.990

2.106

1.554

1.067

p


0.05

0.05

0.05

0.05

1.2實驗方法

抽取患者血液提取DNA,取100μl血液加入離心管,加入PBSSolution100μl混勻,加入ProteinaseK20μl,加入Buffer CL200μl56℃水浴10min,加入污水乙醇混勻,置入收集管中放置2min10000rpm離心1min,吸附置入收集管,加入CW1Solution500μl,離心30s,棄掉廢液后加入CW2Solution500μl,離心30s棄掉廢液,將收集管于12000rpm室溫離心1min,離去CW2 Solution,將吸附柱放入一個新的離心管加入CE Buffer 50μl,靜置3min,室溫離心2min收集DNA溶液。提取的DNA放于-20℃冰箱保存。全血基因組DNA抽提試劑盒由生物工程(上海)股份有限公司提供。

PNPLA3基因檢測:進行PCR擴增反應,應用瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行鑒定,向干凈燒瓶中加入50ml 5×TBE溶液,隨后加入450ml蒸餾水,充分混勾制成0.5×TBE溶液,將1g瓊脂糖加入燒瓶,將已經加好試劑的燒瓶放入微波爐中,高溫加熱2min至燒瓶中液體沸騰,取出后待凝膠冷卻到50℃左右加入Ultra Power核酸染料搖晃混勻,靜置3-5min。進行電泳反應,加入制備好的0.5×TBE溶液至電泳槽,加入5μl DNA MarkerPCR產物Loading Buffer混合物,電壓設置為1OOV, 30min后取出,拿至紫外燈下鑒定。

Sort1基因檢測:取規格為1.5mlEP管中配置PCR master mix,PCR引物由北京博淼生物科技有限公司提供,引物濃度為1μmol/L,保存于-20℃冰箱備用,在384孔板的每個加樣孔中加入4μl PCR master mix,加入1μl模板DNA進行混勻,進行PCR擴增反應,在10μlPCR產物中加入5U SAP酶和2U Exonuclease I酶,恒溫水浴1h,75℃下滅活15min,連接反應后將連接產物稀釋取0.5μl0.5μl Liz500 SIZE STANDARD9μlHi-Di混勻,變性后使用MALDI-TOF質譜儀分析。

1.3統計學處理

統計分析采用SPSS19.0軟件,計量資料采用均數±標準差表示,多組間比較使用方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗;計數資料比較使用c2檢驗;遺傳平衡性檢驗采用Hardy-Weinberg檢驗。檢驗水準a=0.05。

2結果

2.1PNPLA3、Sort1基因多態性結果

PNPLA3基因rs738409位點檢測出CC、CG、GG三種基因型,Sort1基因rs646776位點檢測出CC、TC、TT三種基因型,各組PNPLA3、Sort1基因多態性分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2.2 各組PNPLA3、Sort1基因多態性分布比較

病例組PNPLA3基因GG型和等位基因G的比例分布明顯高于無肝病嗜酒組和對照組(c2=28.44512.834,36.64214.504,p0.05),見表2;各組Sort1基因多態性分布差異比較無統計學意義(p0.05),見表3。

2 各組PNPLA3基因多態性分布

組別

例數

基因型


等位基因

CC

CG

GG


C

G

對照組

200

12160.50

6532.50

147.00


30776.75

9323.25

無肝病嗜酒組

100

5454.00

3737.00

99.00


14572.50

5527.50

病例組

110

3632.73

4843.64

2623.64


12054.55

10045.45

c2


30.612


34.115

p


0.05


0.05

3 各組Sort1基因多態性分布比較

組別

例數

基因型


等位基因

CC

TC

TT


C

T

對照組

200

42.00

3819.00

15879.00


4611.50

35488.50

無肝病嗜酒組

100

33.00

2020.00

7777.00


26(13.00)

174(87.00)

病例組

110

21.82

1412.73

9485.45


18(8.18)

202(91.82)

c2


2.981


2.709

p


0.05


0.05

2.3 病例組各PNPLA3、Sort1基因型血脂水平比較

病例組不同PNPLA3基因型患者TG、TC、HDL-CLDL-C比較差異無統計學意義(p0.05);病例組Sort1基因TT型患者TG高于CC+CT型患者,而HDL-C低于CC+CT型患者(p0.05)。見表4。

4病例組各PNPLA3、Sort1基因型血脂水平比較

基因型

例數

TGmmol/L

TCmmol/L

HDL-Cmmol/L

LDL-Cmmol/L

PNPLA3基因






CC

121

1.55±0.54

5.41±0.68

1.84±0.46

3.17±0.92

CG

65

1.57±0.41

5.38±0.70

1.82±0.41

3.18±0.90

GG

14

1.56±0.48

5.40±0.67

1.85±0.50

3.20±0.99

F


1.204

0.897

1.115

1.064

p


0.05

0.05

0.05

0.05

Sort1基因






CC

4

1.50±0.22

5.37±0.84

1.90±0.68

3.16±0.87

TC

38

1.51±0.21

5.40±0.91

1.89±0.71

3.19±0.90

TT

158

1.61±0.30ab

5.39±0.89

1.80±0.65ab

3.18±0.89

F


6.221

1.106

5.246

1.112

p


0.05

0.05

0.05

0.05

注:aCC型比較p0.05;bTC型比較p0.05。

3討論

酒精性肝病屬于臨床常見的肝損傷類型之一,主要是由于長期酗酒導致,會帶來社會不穩定、家庭矛盾等多種風險,酒精對于肝臟的損害在及時戒酒后一段時間內仍會繼續進展,目前對于本病的發病機制研究尚不清楚,因此有效的治療方法不多,主要以肝功能的保護為主[3-4]。目前認為酒精性肝病主要是遺傳因素與環境因素共同作用結果,長時間大量酒精攝入、高脂肪高熱量飲食均可能造成疾病發生,近年來隨著全基因組關聯研究發現PNPLA3基因和Sort1基因均可能和多種疾病發生發展有關,但是傳統的研究多數集中在肝癌、病毒性肝炎中,在酒精性肝病的研究報道較少[5]。有報道指出脂肪變性是酒精性肝損傷的早期階段,通過脂質過氧化反應以及細胞因子激活會引發肝細胞的炎癥反應,最終進展為纖維化[6-7]。近年來全基因組關聯分析一直是重要的觀察基因變化手段,通過測定特定物種不同個體間的基因來了解基因變化情況,對確定遺傳和表型以及基因和疾病的關聯性具有重要研究意義[8-9]。本研究擬在通過對PNPLA3基因和Sort1基因多態性情況和酒精性肝病易感性之間關系,以期為臨床提供一定的依據。

PNPLA3patatin磷脂酶家族,編碼基因在22號染色體長臂133亞帶1次亞帶,可以編碼非分泌性蛋白,這一蛋白是481個氨基酸所組成的,具有非特異性;饷富钚,具有高度水解序列,PNPLA3活性中心絲氨酸就在此序列,和天冬氨酸進行結合,這個結合的二元體就是發揮催化作用的關鍵部位[10]。PNPLA3在人類各組織中均有廣泛表達,而肝臟和脂肪組織表達最多,尤其是發生變異后會造成肝細胞脂肪分解代謝變化,肝臟的脂肪堆積增多,促進脂肪肝的形成,而且還會降低甘油三酯在細胞間的運輸動力,使得他們更容易受到脂質過氧化,進而導致氧化應激,對肝細胞造成損傷和炎癥[11];此外還可通過造成肝臟脂肪變性及肝細胞的炎癥而對肝纖維化產生影響,肝細胞損傷和炎性介質的釋放會導致庫普佛細胞二次活化,放大炎性反應進而導致肝細胞死亡,肝星狀細胞活化,肝臟纖維程序激活[12]。有學者研究發現PNPLA3的基因多態性同肝臟脂肪含量增多以及肝臟纖維化程度密切相關。Stickel F等人研究德國兩組人群rs738409位點的多態性,發現該位點多態性可能通過介導肝臟脂質沉積引起酒精性肝病患者炎癥反應的發生與進展,發現PNPLA3 rs738409基因多態性與酒精性肝病的發生以及進展為肝硬化相關[13]。

分揀蛋白1Sort1)屬于一個新的脂質代謝調節基因,與低密度脂蛋白代謝相關,主要定位在跨高爾基體網狀結構上,在溶酶體轉運蛋白質的過程中起到了重要的作用,Sort1基因主要包含在染色體1p13.3上,利用染色體基因圖譜繪制的表達數量性狀位點分析顯示,Sort1次要等位基因C純合子在肝臟中表達增高,但是次要等位基因純合子在內臟脂肪中不表達,說明了1p13.3區域具有肝臟特異性[14]。加拿大學者研究發現,青少年人群中攜帶次要等位基因C的純合子能夠降低青少年人群中甘油三酯與極低密度脂蛋白水平[15]。

本研究顯示,PNPLA3基因rs738409位點檢測出CC、CG、GG三種基因型,Sort1基因rs646776位點檢測出CC、TC、TT三種基因型,酒精性肝病患者PNPLA3基因GG型和等位基因G的比例分布明顯高于無肝病嗜酒組和對照組,說明PNPLA3基因GG型和等位基因G人群容易發生酒精性肝病。但是酒精性肝病的發生同Sort1基因分布無相關性。但是在對酒精性肝病患者血脂水平同兩種基因型分析發現,酒精性肝病患者不同PNPLA3基因型患者TG、TC、HDL-CLDL-C無差異,但是Sort1基因TT型患者TG高于CC+CT型患者,而HDL-C低于CC+CT型患者,說明Sort1基因TT型可能是酒精性肝病患者的保護基因。本研究優勢在于從基因學層面分析了PNPLA3基因、Sort1基因同酒精性肝病的發生之間關系,開展了初步研究,提供了酒精性肝病遺傳學研究的相關證據,有希望從該基因關鍵分子入手發現更為敏感的、可信的生物學指標用于臨床ALD發病風險預測,并從遺傳學角度闡明酒精性肝病發生、發展的機制,為進一步的針對該基因靶向治療提供理論依據。但是受限于實驗時間、經費有限,本實驗選取樣本數量較少,且未采取多中心聯合實驗,不能完全排除相應的抽樣誤差,還有待進一步深入分析論證。

綜上所述,PNPLA3基因多態性與酒精性肝病易感性有一定關系,Sort1基因多態性與酒精性肝病易感性無明顯關系,但與患者血脂水平相關。

參考文獻

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